微生物能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物，例如DNA嵌入剂。然而，由于传统活性测试的灵敏度和专一性存在局限，寻找新的DNA嵌入剂依然是一项挑战，这通常涉及到大规模的发酵和提纯过程。对单个DNA分子的力学操纵拓展了我们对DNA的物理特性、DNA与小分子化合物相互作用的深入理解。从微生物中发掘DNA结合化合物是抗肿瘤药物发现的重要来源。单分子生物物理技术与天然产物化学的结合，以及合成生物学技术新的融合，为活性天然产物的发掘带来了新的可能。
近日，华中科技大学同济医学院药学院蔡晓凤教授和游慧娟教授团队合作，在学术期刊Nucleic Acids Research发表了题为“Force-enhanced sensitive and specific detection of DNA-intercalative agents directly from microorganisms at single-molecule level”的研究论文，本研究介绍了单分子操纵技术直接在微生物培养或提取中筛选产生DNA嵌入剂的微生物的开创性应用。
核酸结合的化疗药物如阿霉素、柔红霉素和喜树碱等是癌症治疗的重要药物。据统计，从1949到2019年大约有17%已批准上市的抗肿瘤药物为核酸结合化合物，其中一半来源于微生物或者植物中所发现的天然产物。部分微生物通过产DNA结合化合物可以获得环境中的竞争优势。然而，传统的检测方法受其灵敏度和特异性的限制，很难从微生物中识别微量的此类化合物，通常需要大规模培养（>10升液体或者1千克固体培养）和复杂的分离纯化，才能得到微克级别的化合物进行进一步的分析鉴定。
图1.单分子磁镊应用于挖掘微生物来源的新型DNA嵌入剂
单分子操纵技术如光镊、磁镊、原子力显微镜能够实现对单个DNA和蛋白分子的力学操纵，并被广泛运用于DNA和小分子化合物相互作用的研究中。然而，此前的单分子技术并未用于复杂样品的直接检测，如微生物和植物提取物。本研究首次证明了在无需纯化的情况下，可以直接从5微升菌液或者微生物粗提物中鉴定纳摩尔级别的DNA嵌入剂。该检测基于DNA嵌入剂在受力时导致DNA末端长度增加的原理。这种DNA轮廓长度的增加是嵌入剂的特有现象，受溶液的离子条件，微生物初级代谢产物或蛋白质结合的影响很小。此外，对DNA施加外力能够提升化合物的结合亲和力并增加配体嵌入数量，提高检测灵敏度。因此，单分子操纵技术提供了一种无需纯化、高灵敏度和高特异性的新方法，用于挖掘微生物来源的DNA嵌入剂。
本研究通过单分子结合换液的方法分析了来自17个不同种的微生物培养物，包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌，成功筛选出两种产DNA嵌入剂的菌株：Streptomyces tanashiensis与Talaromyces funiculosus。通过次级代谢产物生物合成基因簇分析、液质联用技术以及化学分离等手段，鉴定了三种DNA嵌入剂，merdemycin，kalafungin和ligustrone B,其中，kalafungin和ligustrone B是首次证实具有DNA嵌入活性的天然产物。本研究结果表明单分子力谱方法在活性天然产物挖掘中具有很好的应用前景。此外，值得注意的是，磁性镊子与微流体流动室的集成允许缓冲交换，使其非常适合测量同一室中的多个样品。这展示了单分子操纵技术可以有效处理复杂样品的能力，包括那些可能含有具有遗传毒性风险的DNA插入物的样品，强调了其在环境监测应用中的适用性。
图2.单分子磁镊实验筛选产DNA嵌入剂的菌株
华中科技大学药学院硕士研究生刘天宇和蔡腾为共同第一作者，蔡晓凤教授和游慧娟教授为共同通讯作者，中国科学院微生物研究所刘宏伟研究员，山东大学李爱英教授，华中科技大学万落生教授，卢瑶副教授也参与了该研究。
原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkae746
