5月8日，国际生物学权威杂志《核酸研究》（Nucleic Acids Research）在线发表了药学院吴曈勃教授团队的最新研究成果《Exploring the Effect of Activator Topology on CRISPR-Cas12aTrans-Cleavage Activity》。
CRISPR-Cas12a系统因其高灵敏度、高选择性和设计简便，在核酸检测和生物传感领域得到了广泛应用，被誉为“下一代检测工具”。然而，传统的Cas12a生物传感器的设计依赖于线形激活剂，在可操作性与稳定性方面存在很大程度的局限性。
吴曈勃团队首次从线形、平面、立体结构三个维度系统地探究了CRISPR/Cas12a系统的激活剂拓扑结构对反式切割活性的影响（图1）。在此基础上，团队发现了在保持激活剂长度不变的情况下，可通过拓扑结构抑制Cas12a顺式切割活性进而提高其反式切割活性的一般规律，并且提供了一种高灵敏度Cas12a传感器的设计方法。团队构建了一种基于平面激活剂的Cas12a开关，该开关具有灵活的可操作性，可在较长时间保持高于线形激活剂的活性，并且可高灵敏响应体系中存在的次氯酸，检测限低至88 nM，普遍优于现有的化学探针检测方法。该研究提供了大量活性优于传统线形激活剂的拓扑激活剂，为开发Cas12a生物传感器开辟了新的途径，具有较高的应用潜力。
图1 CRISPR/Cas12a系统拓扑激活剂的设计及其可操作性
团队首先通过向激活剂的PAM区以及原间隔区引入气泡，发夹等结构设计了多种类型的线形结构底物（图2），并且分别探究了各种底物的反式切割活性。在此基础上，团队深入解析了激活剂产生促进或抑制作用的机制。
图2线形结构底物对酶活性的影响
受线形底物设计的启发，团队通过扩大特殊结构在整体中的占比进一步设计了平面结构的底物（图3）。通过探寻其反式切割活性，团队探寻到一种激活作用明显强于传统线形激活剂的回折平面结构。团队通过荧光表征的方法探究了回折结构底物产生激活作用的机理，提出了拓扑结构通过抑制Cas12a的顺式切割活性进而提升反式切割活性的机理。
图3平面结构底物对酶活性的影响
接下来，团队通过引入立体框架设计了刚性更强的四面体及六面体立体结构（图4）。通过探究各个结构的反式切割活性，团队发现立体结构框架并不会产生抑制作用。相反，通过合理的设计可以得到活性更强的立体底物。由于四面体结构具有良好的抗酶解作用，立体结构底物可以提高传感系统的稳定性以及便于细胞成像的应用。
图4立体结构底物对酶活性的影响
次氯酸可特异性水解DNA骨架中的磷硫酰化位点，进而引发DNA骨架断裂。团队设计了磷硫酰化的平面结构底物以高灵敏响应体系中的次氯酸（图5）。由于磷硫酰化的平面结构的优良的可操作性以及高灵敏度，该传感系统可以检测到浓度低至88 nM的次氯酸，显著优于现有的化学探针法。
图5基于Cas12a拓扑开关的高灵敏度次氯酸传感系统设计
总结：本研究基于DNA碱基配对原理，设计了具有线性、平面和立体三种拓扑结构的Cas12a激活剂，并系统性地探讨了激活剂拓扑结构对Cas12a反式切割活性的影响，归纳出可指导激活剂设计的一般性原则，为CRISPR-Cas12a生物传感器的开发提供了新的思路。
药学院2024级博士朱梓轩与2022级博士李小龙为本文共同第一作者。朱梓轩为药学院2020级药学启明本硕博实验班本科生，经过实验室轮转和大创项目训练，在2023年9月份正式通过考核加入吴曈勃教授课题开展科研训练，在李小龙的合作帮助下共同完成毕业设计。本成果是其毕业设计的完善和延续。启明实验班的本研衔接培养机制保证了学生足够的科研时间投入。
原文链接：https://academic.oup.com/nar/article/53/8/gkaf311/8117948
